Kolumbus taufte 1492 die Insel Hispaniola und durch einen Erlass des Königs Ferdinand wurde sie im Jahre 1508 Santo Domingo genannt.
Nach seiner erfolgreichen ersten Entdeckungsreise lichtete Christoph Kolumbus erneut die Anker für eine Fahrt nach Amerika. Die Flotte bestand aus 17 Schiffen und 1300 gut ausgerüsteten Männern. Die Kosten für die Expedition betrugen 5 Millionen Maravedies, für die der Herzog von Medinasidonia aufkam, der sie wiederum von den spanischen Juden konfisziert hatte.
Nach der Entdeckung der heutigen Inseln Dominica, Guadalupe und Puerto Rico während der zweiten Reise, kam er am 27. November 1493 auf der Insel Hispaniola an. Dort erfuhr er, dass die erste Festung La Navidad (im heutigen Haiti gelegen) von den Einheimischen zerstört worden war, und dass die erste Siedlung mit 40 Männern, die im Namen der Katholischen Könige von Spanien errichtet wurde, vernichtet worden war.
Am 7. Dezember verliess Kolumbus mit der gesamten Kriegsflotte La Navidad, auf der Suche nach einem neuen Sitz für die Siedlung. Er segelte Richtung Osten, aber widrige Winde hinderten ihn daran, weiter als Puerto de Gracia zu gelangen. Dieser Ort lag ungefähr 30 Kilometer von Puerto Plata entfernt, einer Stadt, die er als Hafen für ungeeignet hielt. Er segelte zurück und wählte schliesslich, nach einer verunglückten Fahrt durch Unwetter und mit einer verärgerten Mannschaft, einen Ort in der Nähe der Bajabonico-Mündung aus. Dieser Ort war laut De Las Casas, in seiner Geschichte der Entdeckung der Westindischen Inseln, ein guter Hafen, obwohl er dem Nord-West-Wind ausgesetzt ist.
Kolumbus entschloss sich, dort zu siedeln, und befahl der Mannschaft, ans Land zu gehen. Am 2 Januar gründete er La Isabela, die erste christliche Siedlung der Neuen Welt, und im selben Jahr wurde zum ersten Mal auf diesem Kontinent die Messe gelesen. Von La Isabela aus brachen Expeditionsgruppen auf, die gegen die Einheimischen, die ihr Land verteidigten, kämpften. Von ihnen wurden die beiden Festungen Santa Catalina und Esperanza am Ufer des Yaque del Norte-Flusses gegründet.
Miguel Diez, ein Soldat aus Aragón, der in der Siedlung La Isabela bei einem Streit einen Mann ermordet hatte und danach geflohen war, entdeckte in der Nähe des Haina-Flusses eine Goldgrube. Er dachte, dass man ihn aufgrund dieser sensationellen Nachricht über den Goldfund freisprechen würde, was dann später auch der Fall war. Kolumbus schickte daraufhin seinen Bruder Bartolomé und Francisco de Garay an den Ort, um sich von der Existenz der Goldmine zu vergewissern. Sobald die Tatsache feststand, bauten sie am linken Ufer des Haina-Flusses eine Befestigungsanlage, die sie Buenaventura nannten.
Don Bartolomé wurde zum Gouverneur Adelantado ernannt und erhielt vom Admiral aus Cadiz den Befehl, die Südküste der Insel zu erforschen, und dort schnell einen Hafen zu finden, an dem man eine Siedlung gründen kann. Er befahl ihm ausserdem, La Isabela aufzulösen und alles an den neuen Ort zu bringen.
Nachdem er die Küste ausführlich bereist hatte, fand Don Bartolomé den geeigneten Ort an der Mündung des Ozama-Flusses, wie ihn die Einheimischen nennen; ein sehr schöner Fluss, der an beiden Ufern völlig besiedelt ist. Dort gründete er am 4. August 1496 La Nueva Isabela. Diese neue Siedlung wurde später nach der christlichen Heiligenlegende in Santo Domingo de Guzmán, umbenannt. Das Gründungsdatum der Stadt wurde zum Streitpunkt der Historiker. Viele behaupten, dass die Stadt zu diesem Zeitpunkt aus praktischen Gründen nicht gegründet worden sein konnte, und auch der berühmte Historiker Fray Leopoldo de Utrera setzt das Gründungsdatum im Jahre 1498 an. Andere Historiker haben nach längerer Erforschung das erste Datum als offiziell anerkannt.
Die Stadt wurde ursprünglich am östlichen Ufer des Ozama-Flusses gegründet aber kurz danach, im Jahre 1502, aus unbekannten Gründen an das Westufer verlegt. Man hat darüber allerlei Vermutungen angestellt, zu den am häufigsten vertretenen Mutmassungen gehört die schlechte Wasserversorgung, aber auch eine Rotameisenplage könnte eine mögliche Ursache dafür gewesen sein. Am wahrscheinlichsten ist es jedoch, dass ein Orkan die Siedlung zerstörte, und der Gouverneur Nicolás de Ovando sie aus diesem Grund an einen sichereren Ort verlegte. Von der ersten Siedlung am linken Ufer des Ozamas ist nur noch eine kleine, unscheinbare Kapelle, La Capilla de los Remedios, erhalten. Von der Altstadtmauer aus kann man sie noch heute links von den Getreidemühlen sehen.
1506 teilte Ovando den spanischen Königen mit, die Stadt hat gut angelegte, gerade Strassen, breiter als die in Granada. Man beging nicht den Fehler, die Häuser aus Holz und Stroh zu bauen, was der Hauptgrund für die Zerstörung der ersten Siedlung durch den Orkan war. Statt dessen zog man Steine und festes Mauerwerk vor.
1655 verhinderte der Graf von Peñalva als Gouverneur der Insel, dass England die Stadt einnahm. Die Haupteinkaufsstrasse und Fussgängerzone El Conde trägt heute den Namen zu Ehren von ihm.
Der erste Bürgermeister von Santo Domingo war Miguel Diaz, der Entdecker der Goldminen von Haina, der mit Catalina, einer Einheimischen und Angehörigen des niederen Adels ihres Volkes, verheiratet war.